FAQ sur les milieux de culture cellulaire

Foire aux questions (FAQ) sur les milieux de culture cellulaire

I. Sélection du milieu de culture cellulaire

1. Comment choisir un milieu adapté à mes cellules ?

• Référence principale : Le milieu utilisé pour établir la lignée cellulaire spécifique est généralement le premier choix. Consultez la documentation pertinente ou votre fournisseur de cellules.
• En fonction du type de cellule et de l'expérience :
  • Les lignées cellulaires de souris sont souvent cultivées dans RPMI1640.
  • Pour l'hybridation cellulaire, les expériences de transfert de gènes, IMDM peut être choisi.
• Méthode empirique (recommandée) : Cultivez des cellules dans plusieurs types de milieux et comparez les résultats à l'aide d'indicateurs tels que les courbes de croissance et l'efficacité du placage pour sélectionner le milieu optimal.
• Consultez les bases de données faisant autorité : Le ATCC (Collection américaine de cultures typographiques) Le site Web fournit des informations détaillées sur la culture de la plupart des lignées cellulaires, y compris les milieux recommandés, les conditions et la documentation associée.

II. Stockage et durée de conservation

2. Le milieu liquide peut-il être conservé à -20°C ?

• No. Le stockage à -20 °C peut entraîner la précipitation des sels présents dans le milieu. Lors de la décongélation, ces sels peuvent ne pas se redissoudre complètement, ce qui entraîne une diminution de l'osmolarité. Ceci peut entraîner la rupture et la mort des cellules.

3. Combien de temps peut-on conserver le milieu liquide nouvellement préparé ?

• Il est recommandé de conserver le milieu nouvellement préparé à 4°C à l'abri de la lumière et l'utilise dans la semainePlus le support est frais, mieux c'est.

4. Le milieu supplémenté en sérum et en antibiotiques peut-il être conservé à long terme ?

• Non. Une fois le sérum et les antibiotiques ajoutés au milieu frais, celui-ci doit être utilisé dans les deux à trois semainesCertains antibiotiques et composants essentiels du sérum commencent à se dégrader après décongélation.

5. Pourquoi le milieu conservé au réfrigérateur devient-il rouge foncé (alcalin) ?

• Conservé à 4°C, Le CO₂ s'échappe progressivement du milieu, provoquant une augmentation du pH (devient plus alcalin). L'indicateur de pH rouge de phénol devient d'un rouge-violet plus foncé dans des conditions alcalines.
• Solution Le pH peut être ajusté par barbotage CO₂ stérilisé par filtre à travers le milieu avant utilisation.

III. Composants et additifs

6. Est-il nécessaire d’ajouter des antibiotiques au milieu ?

• Généralement non recommandé. Les antibiotiques ne doivent pas être ajoutés aux cultures de routine pour éviter de masquer des contaminations subtiles ou d'exercer des effets cytotoxiques sur les cellules.
• Exception: Pour éviter la contamination bactérienne/fongique, Pénicilline-Streptomycine (Pen-Strep) peuvent être ajoutés. Les concentrations finales courantes sont de 100 U/mL de pénicilline et de 100 µg/mL de streptomycine.

7. La concentration d’antibiotique doit-elle être ajustée pour une culture sans sérum ?

• Oui, réduisez le montant. La concentration d’antibiotiques doit être réduite de  investissent au moins 50 % par rapport à la concentration utilisée dans les milieux contenant du sérum. Les protéines sériques se lient à certains antibiotiques et les inactivent ; cette inactivation ne se produit pas en conditions sans sérum.

8. Pourquoi certaines expériences nécessitent-elles un milieu sans rouge de phénol ?

• Deux raisons principales :
  1. Effets hormonaux: Le rouge de phénol peut imiter les effets des hormones stéroïdes (en particulier l’œstrogène), interférant avec les expériences utilisant des cellules sensibles aux hormones.
  2. Interférence avec la détection : Les propriétés de fluorescence du rouge phénol peuvent interférer avec les méthodes de détection comme la cytométrie de flux.

9. Quelles sont les fonctions des composants des supports courants ?

• NaHCO₃ (Bicarbonate de sodium) : Forme un système tampon avec le CO₂ pour maintenir un pH stable dans l'incubateur.
• Pyruvate de sodium : Sert de source alternative de carbone pour les cellules (en cas de faible taux de glucose). Sa concentration finale habituelle est : 1 mM.
• HEPES : Un tampon chimique puissant qui assure une stabilisation supplémentaire du pH, notamment hors de l'environnement d'incubation à CO₂. La concentration finale courante est : 25 mM.
• Rouge de phénol : Agit comme un indicateur de pH (Rouge = Neutre ~7.4, Jaune = Acide, Violet = Alcalin).
• L-Glutamine : Un acide aminé essentiel pour les cellules, impliqué dans le métabolisme énergétique et la synthèse des protéines. instable en solution et doit être conservé congelé à -20 ° C. On l'ajoute généralement au milieu juste avant utilisation. La concentration finale courante est 2 mMLe milieu supplémenté en glutamine doit être ré-supplémenté s'il est conservé à 4°C pendant plus de 2 semaines.

IV. Influence du pH

10. Comment le pH du milieu affecte-t-il la croissance cellulaire ?

• Le pH optimal pour la plupart des cellules est 7.2:7.4 – XNUMX:XNUMXLes écarts par rapport à cette plage peuvent être nocifs.
• Les cellules tolèrent généralement une acidité douce est meilleure qu'une alcalinité douce.
• Note: Le pH du liquide augmente souvent de ~ 0.2 unités après filtration à travers un filtre de 0.1 µm ou 0.2 µm.

11. Pourquoi notre milieu RPMI 1640 est-il jaune ? Le pH est-il mauvais ?

• Ceci est normal. De par sa formulation, le RPMI 1640 est une variante à faible teneur en rouge de phénol ; il ne contient que un quart Quantité de rouge de phénol présente dans le DMEM. La couleur plus claire et jaunâtre est due à cette concentration plus faible, et non à un pH trop bas.