Comment détecter les mycoplasmes avec un écouvillon

La détection des mycoplasmes avec un écouvillon implique généralement plusieurs étapes, notamment le prélèvement d'échantillons, l'extraction de l'ADN et les tests moléculaires. Voici un aperçu général du processus :

Les matériaux nécessaires:

• Écouvillons stériles
• Milieu de transport (par exemple, PBS ou milieu de transport spécifique aux Mycoplasmes)
• Kit d'extraction d'ADN
• Réactifs et équipements PCR
• Amorces spécifiques à la détection des mycoplasmes
• Appareil d'électrophorèse sur gel ou machine PCR en temps réel

Procédure étape par étape :

1. Prélèvement d'échantillon :

1. Préparation :

• Portez des gants stériles et utilisez des techniques aseptiques.
• Assurez-vous que les écouvillons et le milieu de transport sont stériles et prêts à l’emploi.

1. Écouvillonnage:

• Frottez doucement l'écouvillon sur la zone suspectée (par exemple, culture cellulaire, gorge, zone urogénitale) pour prélever l'échantillon.
• Placez immédiatement l'écouvillon dans le milieu de transport pour préserver l'échantillon.

2. Extraction d'ADN :

1. Lyse :

• Transférez l'écouvillon dans un tube contenant le tampon de lyse du kit d'extraction d'ADN.
• Incuber selon les instructions du kit pour lyser les cellules et libérer l'ADN.

1. Purification:

• Suivez le protocole du kit d’extraction d’ADN pour purifier l’ADN. Cela implique généralement de lier l’ADN à une colonne, d’éliminer les contaminants et d’éluer l’ADN purifié.

3. PCR (réaction en chaîne par polymérase) :

1. Préparer le mélange PCR :

• Préparez un master mix contenant :
  • Modèle d'ADN (issu de l'étape d'extraction)
  • Amorces spécifiques aux mycoplasmes
  • les dNTP
  • Taq polymérase
  • Solution tampon

1. Amplification:

• Configurez la machine PCR avec les conditions de cycle appropriées (généralement dénaturation initiale, suivie de cycles de dénaturation, de recuit et d’extension).

1. Détection:

• Pour la PCR finale, exécutez les produits amplifiés sur un gel d'agarose et colorez-les avec un colorant liant l'ADN (par exemple, le bromure d'éthidium) pour visualiser les bandes sous la lumière UV.
• Pour la PCR en temps réel, surveillez l’amplification en temps réel à l’aide d’un colorant ou d’une sonde fluorescente.

Interprétation des résultats:

• Résultat positif:
• La présence de bandes spécifiques en électrophorèse sur gel ou un signal positif en PCR en temps réel indique la présence d'ADN de mycoplasme.
• Résultat négatif:
• L'absence de bandes spécifiques ou l'absence de signal d'amplification suggère l'absence d'ADN de mycoplasme.

Considérations supplémentaires:

• Contrôles :
• Incluez des contrôles positifs et négatifs dans votre PCR pour valider les résultats.
• Prévention de la contamination :
• Utilisez des zones séparées pour la préparation des échantillons, la configuration de la PCR et l’analyse afin d’éviter toute contamination.
• Nettoyez régulièrement les surfaces de travail et l'équipement avec des agents dégradant l'ADN.

Ce processus garantit une détection précise des mycoplasmes dans vos échantillons. Pour les applications cliniques, suivez toujours les directives et protocoles recommandés par les autorités et institutions sanitaires compétentes.